Q1：质粒模板无法正常扩增。

A1：(1) 引物设计有误：核对引物设计方案；

(2) 扩增体系配制错误：重复实验；

(3) 扩增反应条件不优化：调整Mg²⁺浓度、酶量、扩增程序；

(4) 模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。

Q2：平板上长不出克隆或者克隆数很少。

A2：(1) 感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率需＞10⁷ cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照试验，以检测感受态细胞的转化效率；

(2) 重组反应体系中DNA量不足或比例不佳（双碱基突变）：尽量按照说明书推荐的量配置重组体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大；

(3) 重组环化反应体系中DNA不纯，抑制反应：未纯化DpnI消化产物加入重组体系内的总体积不应超过4ul（反应体系体积1/5）。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂（如EDTA）的带入。因此，我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH₂O中保存（常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用8.0的ddH₂O替代），请勿使用TE进行DNA保存；

(4) 感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率； 

(5) 出现转化抑制效应：当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应，将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

Q3：定点突变未正确完成。

A3：(1) 引物设计错误：核对引物设计方案；

(2) 扩增反应所用模板为非甲基化的质粒：DpnI只能识别甲基化DNA，请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板；

(3) 扩增反应使用过多的模板质粒：对大多数质粒，1ng模板量已足以使扩增反应正常进行，过多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全，降低突变成功率。

Q4：非目标位点突变。

A4：(1) 模板质粒携带未知位点突变：测序确认模板质粒序列正确性；

(2) 扩增循环数过多：为了防止扩增过程中引入非目标突变，扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数应不超过30。