Q1：引物如何设计？

A1：(1) 引物设计：官网引物设计软件CE Design V1.04，选择相应模块进行设计；

(2) 载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切和反向PCR，优先选择双酶切；

(3) 引物由三部分组成：同源臂（15-20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40%-60%）+酶切位点（根据实验需求保留或舍弃）+特异性引物（引物Tm值的计算不包括同源臂的序列）。

Q2：平板上长不出克隆或者克隆数很少。

A2：(1) 引物设计不正确：引物包含15-20 bp同源臂（不计算酶切位点），GC含量40%-60%；若同源臂的GC含量过高或过低，可重新选择插入位点；

(2) 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，即比例不佳：尽量按照说明书推荐的量和比例配置重组体系；

(3) 重组体系不低于10 μl，各组分添加不低于1μl（避免低体积添加造成量取不准）；若载体或片段浓度过低导致添加量超过20 μl，可同比例降低载体和片段的添加量；插入片段长于载体时，重组体系中片段与载体的摩尔比为2:1；

(4) 载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA不应超过4 μl（反应体系体积的1/5）；建议线性化载体和PCR产物进行胶回收纯化，纯化产物溶解在pH 8.0的ddH₂O保存；

(5) 感受态细胞的转化效率需大于10⁷ cfu/μg，重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞(如DH5α/XL10)，不能选择表达用感受态细胞；

(6) 酶切获得的载体应经加热处理失活限制性内切酶，对于加热处理不能失活的酶切体系，必须经过胶回收纯化；

(7) 核查基因是否致死。

Q3：多数克隆含有不正确的插入片段。

A3：PCR产物混有非特异性产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。

Q4：插入片段出现碱基突变。

A4：插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶；若突变发生在同源臂区域，请进行引物序列核对。

Q5：多数克隆不含插入片段。

A5：(1) 克隆载体线性化不完全：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全；对于优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物；

(2) 插入片段获得的PCR体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化，或者进行胶回收纯化。

Q6：阳性对照不长斑或很少。

A6：(1) 平板抗性使用错误：试剂盒中提供的对照载体的抗性为A+抗性；

(2) 感受态细胞效率低：确保转化效率>10⁷cfu/μg，可进行简单检测，将1 ng质粒转化至100 μl感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为10⁷cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；感受态选择克隆感受态（如DH5α/XL10），不能用表达感受态。

Q7：菌液PCR无条带。

A7：(1) 引物不正确：建议使用载体的通用引物进行菌检,或至少使用一条通用引物；

(2) PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证，或着进行酶切验证；

(3) 重组失败：只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。

Q8：菌种（表达用）保存一段时间后出现表达量下降。

A8：菌种在保存过程中，可能会出现质粒丢失，拷贝数降低的情况，重新培养时适当增加抗生素的浓度，筛选出含高拷贝数质粒的细菌。