2021年12月24日，Science在线发表了剑桥大学Yrj Helariutta团队等题为“Cell-by-cell dissection of phloem development links a maturation gradient to cell specialization”的研究论文，利用高分辨率成像和单细胞测序技术剖析植物韧皮部发育经历的细胞学变化及不同时期的基因调控过程。
DOI: 10.1126/science.aba5531
植物的根部发育是随着根的纵轴梯度不断产生新的组织和细胞，这个过程需要植物做好细胞分裂和细胞分化的协调作用。原韧皮部（protophloem）被各种组织所包围，其中的每种细胞以其特定的速度进行分化。值得注意的是，植物的原韧皮部的发育相较于其他植物组织，其发育过程是不断加速进行。作者在本文就原韧皮部各个发育阶段的过程通过多种技术手段展现全景变化轨迹。
前期研究表明，PHLOEM EARLY DNA-BINDINGWITH-ONE-FINGER（PEAR）转录因子通过激活鸟苷三磷酸酶的信号传导启动转录分化程序。这个过程被PLETHORA转录因子的分生区范围内的梯度所抑制。只有PLETHORA梯度的减弱才激活分化程序，此外，早期和晚期分生组织调节器的相互抑制也参与这个过程。不同的成熟程度的转录因子调控和细胞类型共同决定韧皮部细胞分化的不同阶段。
作者为了高分辨率了解原韧皮部发育过程，采用了基于延时共聚焦成像和单细胞转录组学组合的方法，通过韧皮部特异性表达的pPEAR1::H2B-YFP pCALS7::H2B-YFP精确描绘了构成原韧皮部的19个细胞位置共758个细胞的行为。细胞的去核化最后2小时会发生一次，而细胞从出生到去核化至少经过79小时。作者通过单细胞测序发现发育轨迹的转换不是渐变式而是有三个狭窄的过渡时期隔开的四个转录组区域组成。作者描绘出原韧皮部的发育轨迹：“干细胞阶段”、“转运放大”、“过渡”、“早期分化”、“晚期分化”、“极晚期分化”及“去核化”七个阶段（图1）。
图1. 单细胞分辨率下的韧皮部发育。
为了进一步描绘这些具体的细胞分裂过程，作者利用PEAR转录因子集中研究介导了韧皮部和横向相邻的原生细胞早期不对成分裂过程。发现是包括细胞自住和非细胞自主过程。为了确定PEAR功能的潜在下游效应基因，我们重点研究了富集在pPEAR1D::erVenus的表达域的基因。我们发现并验证了原韧皮部大量表达的Rho相关的鸟苷三磷酸酶（GTP酶），植物的Rho 9（ROP9），以及编码PRONE型ROP鸟嘌呤核苷酸交换因子（ROPGEF）的几个基因。这些基因的表达依赖表达依赖于PEAR。在分裂的细胞中，ROPGEFs广泛地聚集在细胞膜上，但在预期的皮质分裂区的位置上却没有，它区分了未来的分裂平面。ROPGEF定位的差距与被称为前阶段带的微管阵列的位置相吻合，这是植物中细胞分裂面的最早标志。作者认为，PEAR促进了细胞分化，包括原韧皮部细胞系的出现，而且至少部分是通过激活ROPGEF-ROP模块来改变细胞分裂的方向（图2）。
图2. PEARs通过促进ROP信号在韧皮部的传导来控制细胞不对称的分裂
早期原韧皮部发育轨迹的另一个明显特征是从细胞分裂到细胞分化的过渡，作者检测到PLETHORA基因家族的转录本会通过细胞间的运动向外扩散。作者假设PLETHORA浓度梯度可能通过允许一组新的转录本的表达来介导第一个转录转变（从II域到III域）向原韧皮部分化。作者通过在几个启动子下驱动PLETHORA2（PLT2）来测试这一假设，这些启动子在原韧皮部阶段的表达比其原生域晚。使用pNAC86::XVE诱导性启动子时，它在结构域V到VII中是活跃的。异位的PLT2延迟了原韧皮部的成核。PLT2可以下调ALTERED PHLOEM（APL）、NAC45/86和NEN4。作者还监测到，在条件性地诱导PLT2后，根部的APL表达域向外转移。PLT2在韧皮部细胞中的诱导超出了其原生域。证实了APL依赖性遗传程序的激活需要PLETHORA梯度的消散。作者还通过染色质免疫沉淀（ChIP）和定量PCR（qPCR）证实PLT2与APL启动子的几个区域直接结合。综上，PLETHORA梯度直接通过细胞自主抑制APL的转录来协调原韧皮部的分化（图3）。
图3. PLT2通过直接抑制APL的表达来抑制韧皮部的分化。
鉴于上述结果，作者推断早期韧皮部特异性转录因子必须激活APL的表达。作者通过与pPEAR1D::erVenus报告的单细胞RNA测序（scRNAseq）图谱的聚类分析中发现的富集基因相交，进一步缩小了筛管发育基因列表范围。我们确定了542个富集在筛管的基因（表S6），并证实了它们在已发表的全根scRNAseq图谱中的特异性。我们用机器学习的方法对伪时序的758个单细胞图谱和4924个高变量基因进行了基因调控建模。大多数已知的原生叶筛管TFs（如APL、NAC045和NAC086）都在前20个富集基因中。作者表明，六个PEAR基因的同时缺失会导致原韧皮部分化的缺陷。APL及其下游靶标NAC045、NAC086和NEN4的表达在PEAR六倍体突变体的原生叶组织中消失。随后，在PEAR1的诱导下，APL和NAC086报告基因在PEAR六倍体突变体中恢复了表达，证实了APL在原韧皮部中的转录激活依赖于PEAR因子的活性。作者使用pPEAR1::PEAR1- GFP蛋白融合物进行ChIP，并在APL启动子（pAPL）内发现多个PEAR1结合位点。对pAPL的截断分析表明，在APL开放阅读框（ORF）上游的2039-2962bp区域内，存在一个负责APL在细胞分裂向细胞分化过渡的增强子元件。ChIP分析在距ORF 2039bp以外的启动子序列中检测到一个强的PEAR1-GFP峰，在2kb区域的上游端检测到另一个强的峰，这两个峰也在公开的DAP-seq数据中检测到。这些结果表明，可能有其他因素在PEARs的下游发挥作用，促进APL在韧皮部发育后期的表达。总的来说，这些数据支持PEARs在控制APL表达的开始以调节韧皮部分化的过渡中的作用。这时期转换是受PLETHORAs控制，通过促进细胞分裂来降低自身浓度梯度实现。当PLETHORA水平充分下降时，PEARs就可以有效地调控APL。通过正向调控PEARS和抑制性的PLETHORAs对APL的对立调控说明了其中的拮抗机制，一个是在分生组织中形成类似形态梯度，一个是在细胞分化协调发育时间（图4）。
图4. PEARs协调了韧皮部的分化。
总之，本文利用细胞分拣、实时显微追踪和转录组技术构建了一个导引原韧皮部发育的高分辨率遗传程序的蓝图。揭示了背后跷跷板式的遗传上相互抑制的机制，激发快速发育转换。
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来源：Mol Plant植物科学
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