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技术文章 |
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Q1:扩增产物少或没有扩增
A1: ① 血液、血卡、拭子等直扩类实验时,确认PCR程序预变性条件为95℃/5 min,以充分释放模板。
② 使用高质量的引物。检查引物是否降解,确认引物终浓度为0.2 μM。
③ 增加PCR循环数。
④ 降低退火温度(间隔1 ~ 3℃),必要时进行退火温度梯度测试。确认退火时间为90 sec,必要时可延长退火时间至3 min。
⑤ 检查单对引物的扩增性能和特异性。
⑥ 使用高质量的模板。确认DNA模板纯度、浓度;增加模板使用量。
⑦ 产物过长,重新设计引物。
⑧ 延长循环内的延伸时间;延长彻底延伸时间。
⑨ 提高低产或缺失扩增子引物使用量。
Q2:存在非特异性扩增
A2: ① 减少循环数。
② 提高退火温度。
③ 减少引物使用量。
④ 重新设计引物。
⑤ 降低酶量。
Q3: 电泳时条带模糊
A3: ① 减少循环数(每次减少3个循环)。
② 减少起始模板量。
③ 延长彻底延伸步骤时间至15 - 30 min。 ④ 降低电泳电压,更换新的电泳缓冲液。