Q1：PM101一次可以扩多少个片段？是否有5’-3’外切酶活性？

A1：一次可以扩19个片段，有5’-3’外切酶活性。

Q2：跑胶后发现条带数量比目的条带数量少。

A2：可能和本身扩增长度有关系，有的条带之间大小太接近。建议通过重新跑胶看一下能不能区分开条带，胶浓度2.5%，用80V电压跑大长胶。

Q3：PM101的扩增产物是平末端还是粘性末端？

A3：粘性末端。

Q4：扩增产物少或没有扩增。

A4：(1) 确认PCR程序预变性条件为95℃ 5 min，以充分释放Multiplex DNA Polymerase活性。

(2) 使用高质量的引物，检查引物是否降解，确认引物浓度为0.1 μM。

(3) 增加PCR循环数。

(4) 降低退火温度（间隔1-3℃），必要时进行退火温度梯度尝试。确认退火时间为90 sec，必要时可延长退火时间至3 min。

(5) 检查单对引物的扩增性能和特异性。

(6) 扩增子高GC或含有复杂二级结构时，推荐尝试Multiplex GC Enhancer，添加终浓度为0.5 - 1.0 ×。

(7) 使用高质量的模板；确认DNA模板纯度、浓度；增加模板使用量。

(8) 产物过长，重新设计引物。

(9) 延长循环内延伸时间、延长彻底延伸时间。

(10) 提高低产或缺失扩增子引物使用量。

Q5：存在非特异性扩增。

A5：(1) 减少循环数。

(2) 提高退火温度。

(3) 减少引物使用量。

(4) 重新设计引物。

(5) 扩增子高GC或含有复杂二级结构时，推荐尝试Multiplex GC Enhancer，添加终浓度为0.5 - 1.0 ×。

Q6：电泳时条带模糊。

A6：(1) 减少循环数（每次减少3个循环）。

(2) 减少起始模板量。

(3) 延长彻底延伸步骤时间至15 - 30 min。

(4) 降低电泳电压，更换新的电泳缓冲液。

Q7：跑PAGE胶，有很多弥散条带，有时候还有微笑条带。

A7：建议延长延伸时间，降低循环数。