Q1：消化组织过大、消化时间过长对体系的影响。

A1：请参照说明书的推荐组织用量和消化时间进行组织的消化处理。一般推荐大小的组织消化20分钟可得到1-2ng/μl的DNA浓度。消化组织过大及消化时间过长会引起体系中杂质成分的大量增加，影响后续的qPCR反应，一般推荐大小的小鼠组织消化时间在10-20分钟能得到较好的扩增效果。小鼠组织重量超过0.01g或适合大小的组织经过消化6小时以上的消化液将不再适合作为后续的qPCR反应检测模板。

Q2：消化组织过小、消化时间过短对体系的影响。

A2：用于消化组织过小（少于0.0005g）、或正常大小组织消化时间过短（少于5分钟）将可能无法释放足量的DNA作为模板用于后续扩增，擅自增加PCR体系中模板的体积以期增加模板量会带入不适合的盐离子，不推荐用于该快速探针法qPCR反应。

Q3：无模板样品的作用。

A3：是否设定无模板样品不会影响软件对结果分析的判断，建议在实验体系尚未完全成熟的条件下每次实验设定一个无模板样品，可有效判断体系污染、扩增特异性差等潜在问题，在成熟的检测体系中可以考虑舍去无模板样品的设定。

Q4：浓度差异导致的不识别。

A4：同一次定量分型实验中如果不同样品的DNA浓度差异过大（如个别点有超过3个及以上的CT值差异），该点极有可能不能被系统正确判断。因此一个批次用于检测的DNA样品的浓度应尽量一致，即原始组织样品内容及大小一致、消化处理时间一致，可以得到基本一致的基因组浓度。需要将不同批次浓度可能有较大差异的模板在一个反应内时行的，应提前将模板按照预期可能存在的浓度差异进行稀释调整，以达到最佳的可分析效果。

Q5：两套引物扩增效率差异导致的不识别。

A5：针对两个基因型定制的两套引物可能存在潜在的互相影响，扩增效率的差异可能产生软件对于杂合子基因型的误判，设计引物时应考虑到这一影响因素，并在实验开展前先进行单引物/探针体系的扩增效率测定，使两个引物/探针体系有接近的扩增效率，对于杂合子来说扩增曲线应尽量重合。

Q6：在一次上机反应中鉴定不同基因的实验需要分别分析。

A6：在一个上机反应中完全可以完成针对不同目的基因的不同引物/探针体系的实验，结果不会互相干扰。但需要注意加样时区分不同目的基因的模板加样孔区域，分析时正确圈中所有同一目的基因的样品孔进行结果分析。

Q7：一组实验中不完全包括野生型、突变纯合和突变杂合导致分析结果错误。

A7：一组实验中不完全包括野生型、突变纯合和突变杂合三种完整的基因型搭配会导致软件不能判断（全部为unidentified）或错误判断样品的基因型（如在缺少野生型对照的条件下把杂合判断为野生），因此一次实验中必须包含全部三种基因型样品，如果不能预期是否全部包含，则应另外设定确定基因型的对照孔以保证软件对未知样品的正确判断。