Q1：扩增效率低，实验组无扩增条带。

A1：(1) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解；引物设计是否合理，可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(2) 模板

长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开，此时加入PCR Enhancer（货号P021），可以有效降低解链温度；模板的AT含量过高，可尝试使用针对高AT的产品（货号P501/P511）；模板为粗品，存在抑制物，建议降低模板浓度（稀释使用；若样本为植物叶片，要确保植物为非多糖多酚植物，取新鲜幼嫩的叶片，并将叶片面积剪小，如黄枪头尖部面积大小）；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。

(3) 酶

反应所用的酶因保存或运输不当而失活，建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。

(4) 扩增体系

反应体系配制错误，建议重复实验。

(5) 反应程序

检查变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实际温度是否相符，如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活，温度过低则模板变性不彻底；若模板为酵母菌，可将预变性时间延长10min；退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度；如果目的片段较长，可尝试Touch Down 程序；检查延伸时间是否充足。

(6) Mg²⁺浓度不合适

Mg²⁺浓度过低可影响PCR产量甚至使PCR扩增失败；Mg²⁺浓度过高会降低PCR的特异性，应适当调整Mg²⁺浓度。

Q2：扩增的条带亮度不太亮。

A2：(1) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。

(2) 模板

首先确认模板的质量，长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；如果模板没有了，可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。

(3) 酶

可适当提高酶的使用量。

(4) 反应程序

可尝试使用Touch Down程序；延长延伸时间，提高循环数。

Q3：扩增特异性差，非特异性扩增。

A3：(1) 引物

引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。

(2) 模板

模板不纯，被污染，需重新制备模板。

模板降解或过量，通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。

(3) 反应程序

反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。

(4) 酶

酶量加入过多。高保真系列：50μl体系加1U。

Q4：扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。

A4：(1) 胶

制胶时要使胶完全融化。

(2) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。

(3) 模板

模板降解或过量，可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长，模板是cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度，逆转录时不加随机引物重新逆转录。

(4) 反应程序

反应程序不够优化。退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度；尝试Touch Down 程序。

(5) 酶

酶量加入过多。高保真系列：50μl体系加1U。

Q5：空白对照出现扩增产物。

A5：(1) 引物设计不合理

扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列。

(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致，说明有污染

更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染，可用巢式PCR方法减轻或消除污染。

Q6：高保真酶扩增保真性差，存在突变。

A6：高保真酶在PCR时扩增产物有突变，可以从以下几点来分析：

(1) 模板本身存在突变

检查模板，若模板是质粒，建议送质粒去测序；若模板是cDNA，建议重复实验，如果仍有突变，可能是cDNA有问题，建议重新制备cDNA，制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。

(2) 模板反复冻融

重新制备模板。

(3) 模板长时间在紫外光下照射，引入突变

切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。

(4) 基因序列与NCBI上的不一致

建议再重复一次送去测序，若结果和上一次一样，说明序列可能和NCBI上的不一致。

(5) 少量序列存在非严谨序列

有相似重组序列，导致重组错位。

Q7：条带大小与理论不符。

A7：(1) 实验体系污染

建议使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

(2) 模板或引物使用错误

建议更换模板和引物。

(3) 存在基因亚型

建议对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

Q8：扩增产物跑胶时加样孔很亮，目的条带很暗。

A8：可能是循环数过多一些非特异性条带、蛋白、目的条带混合在一起形成大分子聚合物跑不下来。可向PCR产物中加入SDS，95℃加热5min，再跑胶。也可扩大体系，多扩几管，最后切胶一起回收。

Q9：逆转录后的产物cDNA作为模板，使用高保真酶，一次应该加多少体积？

A9：说明书建议cDNA模板使用量为1-5μl（不超过PCR反应总体积的1/10），可在这个范围内尝试不同的使用量，摸索最佳使用量。

Q10：高保真酶扩增完的产物是否带A，若后面要做TA克隆该如何进行？

A10：高保真酶扩增完的产物不带A，可尝试使用Vazyme无缝克隆产品C112/C113/C115；若后面做TA克隆可用普通的Taq酶进行加A反应。

具体加A方法：在10μl体系中，加入纯化后的PCR产物1-7μl，同时加入1μl 10×Taq Buffer（含MgCl₂）、0.5μl 10mM dNTPs、0.2μl Taq DNA聚合酶（不加引物），最后用超纯水补足体系，72℃反应10-15min即可。